Le professeur Stangerson et sa fille Mathilde habitent au château du Glandier où ils poursuivent leurs recherches scientifiques. Mathilde est agressée par un homme dans "la chambre jaune", qui a pour uniques ouvertures une fenêtre grillagée et une porte reliée au laboratoire ou se tiennent alors son père et Maître Jacques. Deux coups de feu et des cris retentissent, la porte est fermée de l'intérieur par Melle Stangerson. Lorsque la porte est démontée par son père et son valet, Mathilde est découverte à moitié morte et blessée à la tête. Les volets de la fenêtre sont fermés de l'intérieur ainsi que la porte. Sur le mur, une main d'homme ensanglantée et au sol des traces de pas. Mais pas d'assassin, disparu!! Comment a-t-il pu s'échapper ?
Joseph Rouletabille, un jeune reporter au journal l'Epoque, se rend au Glandier avec Sainclair, son ami avocat pour tenter d'élucider la mystère.